La formación de la colección del Museo responde a diversas formas de ingreso y a las distintas naturalezas de los objetos que la componen marcadas en muchos casos por las circunstancias políticas, culturales y legislativas de cada época.
En el decreto de su creación en 1867 se estipuló la asignación de unos fondos fundacionales, los provenientes del Museo de Medallas y Antigüedades de la Biblioteca Nacional; los objetos arqueológicos y etnográficos del Museo de Ciencias Naturales y la colección de la Escuela Superior de Diplomática. Estos fondos se incrementaron rápidamente con numerosas donaciones y compras a particulares como las destacadas colecciones de Manuel de Góngora, José Ignacio Miró, José de Salamanca o Eduardo Toda.
De especial relevancia fue la actividad de las Comisiones Científicas integradas por personal del Museo que recorrieron diversos lugares tanto de España como del extranjero. Destacan las efectuadas en nuestro país por Paulino Savirón, Juan Sala, Juan Salas Dóriga, Juan de Dios de la Rada y Delgado y Juan de Malibrán, y el viaje que en 1871 realizó la fragata Arapiles a Oriente, del cual regresó con una importante colección de objetos arqueológicos de Sicilia, Atenas, Chipre, la antigua Troya o Constantinopla, entre otros lugares.
Desde el siglo XX, la institución fue cobrando mayor identidad como museo arqueológico. Parte de sus colecciones, como las de etnografía, arte oriental y americanas, se transfirieron a los museos nacionales de Antropología, Artes Decorativas y América, ganando así también más espacio para los numerosos ingresos procedentes de hallazgos y excavaciones arqueológicas, como las cerámicas campaniformes de Ciempozuelos (Madrid), la colección de Luis Siret con materiales de importantes yacimientos del sureste peninsular, o la del marqués de Cerralbo, resultado de sus excavaciones en yacimientos celtibéricos.
A través del intercambio de obras de arte con Francia en los años cuarenta ingresaron, tras haber estado expuestas en el Museo del Prado, las coronas de Guarrazar y la Dama de Elche. En los años setenta se incorporarían obras tan emblemáticas como la Dama de Baza, o el monumento de Pozo Moro, además de materiales de las excavaciones españolas realizadas en Egipto y Sudán fruto de los acuerdos con el gobierno egipcio con motivo de la construcción de la presa de Asuán.
Desde 1985, el ingreso por excavaciones se ha visto notablemente reducido por las competencias que han asumido las Comunidades Autónomas en esta materia, pero el Museo continúa la labor de enriquecimiento de sus fondos a través de adquisiciones por compra y donaciones.